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      【摘要】 目的 探討一氧化氮(NO)在胃癌發病過程中的作用。方法 42例經胃鏡活檢、病理檢查證實為胃癌,采用地高辛標記的誘導型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA探針經原位雜交顯示細胞內的iNOSmRNA的表達情況,並與癌周組織及淺表胃炎組織比較。結果 在42例胃癌患者,iNOSmRNA信號強陽性(+++)11例,中度陽性(++)14例,低度陽性(+)13例,可疑陽性(±)3例,陰性(-)1例;在癌周組織多為(±)或(-);與淺表性胃炎相比,差異有高度顯著性(P<0.01)。結論 大多數胃癌患者的癌細胞內iNOSmRNA表達陽性,提示胃癌細胞自身能產生一氧化氮。

      【中國圖書分類號】:R735.2 R730 R61

      一氧化氮(NO)是生物體內近年來頗受關注的信息傳遞小分子,並與許多疾病發生發展過程有關。由於NO可引起DNA的損傷,導致基因突變,其氧化代謝產物亞硝酸鹽(NO-2)是一個公認的致癌劑,加之在萎縮性胃炎(易發展為胃癌)觀察到隨著萎縮程度的加重胃液中NO-2顯著增加,因此,在胃癌發生過程中可能包含NO機制[1]。目前認為,胃粘膜內NO來源於巨噬細胞和多形核白細胞[2],而胃癌細胞自身能否產生NO尚不清楚。鑒於一氧化氮合酶(NOS)是形成NO的關鍵限速酶,為此,我們觀察了胃癌細胞內誘導型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA(信使核糖核酸)的表達情況,現報告如下。

      1 材料和方法

      1.1 材料及分組

      (1)胃癌組 42例,均經胃鏡檢查及病理檢查證實為胃癌。男20例,女22例,平均年齡49.9±13.5歲(26~72歲)。病理組織學類型:低分化腺癌28例(66.7%),印戒細胞癌5例(11.9%),中、高分化腺癌3例(7.1%),高分化腺癌2例(4.8%),低、未分化腺癌1例(2.4%),未分化腺癌1例(2.4%),中、低分化腺癌1例(2.4%),中、中分化腺癌1例(2.4%)。

      (2)淺表性胃炎組 44例,均經胃鏡檢查及病理檢查證實。男26例,女18例,平均年齡45.4±11.2歲(18~64歲)。與胃癌組比較,性別、年齡均無顯著性差異(P>0.05)。

      1.2 試劑

      地高辛配基標記的iNOSmRNA試劑盒系武漢博士德公司產品,蛋白酶K系德國E.Merck公司產品。

      1.3 方法

      1.3.1 iNOSmRNA原位雜交 按如下步驟進行:①石蠟切片常規脫蠟至水,3%H2O2室溫處理10min以滅活內源性過氧化物酶;②切片滴加25mg/L的蛋白酶K,37℃消化15min,以暴露mRNA;磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗5min×3次;③雜交前的處理及雜交:將地高辛標記探針放入80~90℃水中變性10min,取出後立即插入碎冰中,保持3min。切片空氣中幹燥後,按每張切片加10μl地高辛記探針液,加蓋雜交專用蓋玻片,於37℃濕盒中雜交16~24h;④雜交後洗滌:揭掉蓋玻片,37℃2倍檸檬酸鈉氯化鈉緩沖液(2×SSC)洗滌5min×2次;37℃的0.1×SSC洗10min×1次,洗滌時間應予嚴格控制;⑤滴加封閉液,室溫孵育20min,不洗;⑥滴加封閉液,室溫孵育20min,不洗;⑦滴加鼠抗地高辛抗體於37℃溫箱孵育30min,0.5MPBS洗5min×3次,勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌;⑧滴加生物素化羊抗小鼠IgG於37℃溫箱孵育20min,0.5MPBS洗2min×3次,勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌;⑨滴加鏈青素標記的過氧化物4次,勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌;⑩二氨基聯苯胺(DAB)顯色,充分水洗;⑦酒精脫水,二甲苯透明,封片。

      用緩沖液2×SSC代替探針作空白對照;用(RNase)37℃消化1h作陰性對照;以隨試劑盒所附陽性片作陽性對照。

      1.3.2 iNOSmRNA陽性信號強度評估 采用Fromowitz等[3]染色結果參照Fromowitz等的綜合計分法並稍加改進作半定量分析(附表)。陽性細胞百分比即為某類細胞觀5個視野(每個視野計數100個此類細胞)的陽性細胞平均數;而著色強度則以多數陽性細胞呈現的染色特征計分。

      1.4 統計方法

      所有資料錄入電腦的Office97Excel中,利用Excel97分析和處理資料。統計方法采用t或χ2檢驗。

      2 結果

      2.1 胃癌細胞及癌周細胞內iNOSmRNA

      42例患者中有38例患者的胃癌細胞內可見棕褐色的iNOSmRNA標記物,陽性標記物分布於癌細胞的細胞質和/或細胞核,其中iNOSmRNA信號強陽性(+++)11例,中度陽性(++)14例,低度陽性(+)13例,可疑陽性(±)3例,陰性(-)1例。iNOSmRNA的表達強度與癌組織類型、患者年齡、性別無相關性;在癌周非癌細胞內iNOSmRNA多為(-)、(±)。

      2.2 胃癌與淺表性胃炎細胞內iNOSmRNA陽性率

      42例胃癌患者iNOSmRNA陽性率為90.5%(38例),44例淺表性胃炎患者iNOSmR-NA陽性率為9.1%(4例),兩者差異有高度顯著性(P<0.01)。

      3 討論

      NOS是NO產生的關鍵限速酶。在機體內,該酶分3種類型,即神經原性NOS、內皮細胞性NOS以及iNOS[4]。已經證明巨噬細胞、中性粒細胞、呼吸道上皮、腎小管上皮及內皮細胞等均有iNOS,mRNA。很可能在所有的組織中都產生iN-OS,並作為一種原始類型的免疫系統而起作用[5],但胃癌細胞是否具有該酶活性尚未見報道。

      一氧化氮(NO)是生物體內近年來頗受關注的信息傳遞小分子,並與許多疾病發生發展過程有關。通過細菌和人的培養細胞研究證實,NO能致DNA損傷,其機理可能有二[1]:①NO的氧化產物引起硫氧基團變構,產生致癌的亞硝胺類複合物或引起多胺重氮化,這一系列產物可通過脫胺或交聯引起DNA或RNA堿基變構;②NO可能與O2反應生成過氧化亞硝酸(OONO-),後者分解為OH-和NO-2引起細胞包括核酸在內的廣泛損傷,過氧化亞硝酸可直接將含巰基化合物氧化,引起DNA解鏈。在萎縮性胃炎(易發展為胃癌)觀察到隨著萎縮程度的加重胃液中NO-2顯著增加,由此推測在胃癌發生過程中可能包含NO機制[1],目前認為,胃粘膜內NO來源於巨噬細胞和多形核白細胞,進而引發胃癌[2]。但該觀點似乎與巨噬細胞產生的一氧化氮具有抗腫瘤作用[6]的觀點相悖。本組42例胃癌患者中有38例患者的胃癌細胞內及陽性對照片顯示iNOSmRNA雜交信號,在癌周組織、絕大多數淺表性胃炎、空白對照及陰性對照片上未見iNOSmRNA雜交信號。結果表明,胃癌細胞表達iNOSmRNA,提示胃癌細胞本身能產生一氧化氮,並以其作為一種原始的防禦機制來對抗機體清除作用。有研究表明,NO對LAK細胞(lymphokineactivatedkillercell)活性具有抑制作用[7,8],該作用是否與胃癌的免疫逃逸有關,值得關注。

      作者簡介:鄒益友,男,41歲,碩士,副教授,湖南醫科大學附屬湘雅醫院消化科,410008 湖南省長沙市湘雅路141號

      馮德雲,鄭暉,湖南醫科大學病理教研室,410078 湖南省長沙市湘雅路88號

      伍趕球,湖南醫科大學組織胚胎教研室

      參考文獻(略)

    幼兒鼻子捏不得
    有些人見寶寶鼻子長得有點扁,或是想逗寶寶笑,常用手捏寶寶的鼻子,其實這樣做不利於孩子的健康。因為幼兒的鼻腔粘膜嬌嫩、血管豐富,常捏鼻子會損傷粘膜和血管,降低鼻腔防禦功能,易受細菌、病毒侵犯而得病。  …
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